Nuove ipotesi patogenetiche con prospettive terapeutiche promettenti

Vi segnaliamo un interessante articolo che apre nuove prospettive nell’interpretazione della patogenesi dell’autismo chiamando in causa una disregolazione dei fattori neurotrofici.
Tale ricerca pone inoltre le premesse per terapie innovative, dal momento che un peptide di 11 aminoacidi (denominato Peptide 6) é stato in grado di prevenire gli effetti patogeni dei sieri di bambini con autismo sul neurosviluppo dei ratti. Anche il ricercatore dell’Università di Bologna Giorgio Lenaz ha condiviso il giudizio positivo e ha ritenuto opportuno dare del complesso articolo un ampio resoconto nel quale ha riportato tutti i risultati conseguiti. L’articolo completo è reperibile qui “Sera from Children with Autism Induce Autistic Features Which Can Be Rescued with a CNTF Small Peptide Mimetic in Rats” (fonte NCBI The National Center for Biotechnology Information advances science and health) e di seguito la relazione del dottor Lenaz.

Il siero di bambini autistici induce caratteristiche di autismo che possono essere contrastate da un piccolo peptide simile a CNTF (ciliary neurotrophic factor). Kazim SF, Cardenas-Aguayo Mdel C, Arif M, Blanchard J, Fayyaz F, Grundke-Iqbal I, Iqbal KInge Grundke-Iqbal Research Floor, Department of Neurochemistry, New York State Institute for Basic Research in Developmental Disabilities (NYSIBR), Staten Island, New York, United States of America PLOS One. 13 marzo 2016

INTRODUZIONE
L’incidenza dei disordini dello spettro autistico (ASD) è recentemente aumentata in modo drammatico; il Center for Disease Control and Prevention negli USA comunica che ASD colpiscono negli USA 1 su 88 nati, con prevalenza di 5 volte sui maschi. Anche se l’eziopatogenesi non è chiarita, la letteratura scientifica sembra indicare un’eziopatogenesi multifattoriale comprendente fattori genetici, ambientali e immunologici, abbinata a disregolazione neurotrofica e aumentata sensibilità agli stress ossidativi.
Un fenomeno consistentemente osservato nell’autismo è una accelerata crescita del cervello nelle prime fasi dello sviluppo, seguita poi da crescita diminuita associata a minor numero e dimensione dei neuroni e delle ramificazioni dendritiche in alcune aree cerebrali come l’ippocampo, il cervelletto e l’amigdala. Questi risultati suggeriscono un alterato controllo dei meccanismi dello sviluppo e del differenziamento del sistema nervoso centrale, con sbilancio della formazione e rimozione dei neuroni e delle sinapsi.
Uno dei fattori preminenti nel bilanciamento della normale neurogenesi è rappresentato dal microambiente fornito da vari fattori neurotrofici. La disregolazione dei fattori neurotrofici può senz’altro essere la causa delle anormalità osservate nell’autismo nella neurogenesi, nella migrazione e nel differenziamento neuronale, nella maturazione e connessione delle sinapsi, nonché nella rimozione di neuroni e sinapsi, che portano a deficit del comportamento sociale e dei processi cognitivi.
Vi sono molteplici osservazioni in letteratura di alterazioni dei livelli di fattori neurotrofici nel cervello, nel liquor e nel siero di soggetti autistici. Tali alterazioni potrebbero dipendere in gran parte dallo stress ossidativo nel periodo prenatale e durante le prime fasi dello sviluppo, considerato da vari autori come fattore primario nella patogenesi dell’autismo. Per esempio è stato osservato che uno stress ossidativo blocca nei neuroni l’attività del Fattore Neurotrofico Ciliare (CNTF) che è essenziale per la sopravvivenza ed il mantenimento dei neuroni. Parimenti i livelli serici di Fattore Neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), diminuiti nei bambini autistici, sono stati collegati a un aumentato stress ossidativo.
Viene pertanto ipotizzato che colpire le anormalità neurotrofiche nell’autismo possa rappresentare un utile approccio terapeutico. A riprova di ciò era stato in precedenza osservato che una preparazione neurotrofica peptidergica denominata Cerebrolisina è in grado di proteggere i neuroni corticali dalla neuro-degenerazione indotta da ferro mediante stress ossidativo, di esaltare la neurogenesi nel giro dentato e la memoria ad esso collegata, ed infine di migliorare il comportamento sociale di 17 su 19 bambini autistici.
L’utilizzo terapeutico di questi peptidi, cioè BDNF e CNTF, è limitato dalla lunghezza di queste molecole che pertanto iniettate nel sangue non riescono a raggiungere il cervello e inoltre hanno nel plasma emivite molto brevi. Inoltre era stato anche osservato che CNTF produce gravi effetti collaterali. Per questo motivo gli Autori di questa pubblicazione hanno sintetizzato un peptide di 11 aminoacidi (denominato Peptide 6) che corrisponde alla regione attiva del fattore trofico stesso e che è in grado di superare la barriera ematoencefalica oltre ad avere nel sangue un’emivita ragionevole di circa 6 ore e a non indurre effetti collaterali. Questo peptide CNTF- mimetico nei ratti esercita effetti benefici su neurogenesi, plasticità sinaptica e proprietà cognitive agendo tramite inibizione della via di segnale del fattore LIF (Leukemia Inhibitory Factor) e attivazione del BDNF attraverso una aumentata trascrizione del gene.
In questo lavoro gli Autori hanno dimostrato i seguenti punti:
  1. I sieri di bambini autistici provocano neuro-degenerazione e aumentato stress ossidativo in colture primarie di neuroni murini embrionali al 18° giorno;
  2. L’iniezione intra-cerebro-ventricolare di sieri autistici nel ratto subito dopo la nascita induce il caratteristico fenotipo autistico;
  3. Nei due modelli precedenti, e cioè sia in vitro sia in vivo, il Peptide 6 esercita un effetto protettivo.
RISULTATI
Sieri da bambini autistici inducono morte cellulare e stress ossidativo, corretti da pretrattamento col peptide P6, in colture primarie di neuroni corticali di topo.
Era stato osservato in precedenza che il siero di soggetti autistici impedisce lo sviluppo e la proliferazione di cellule umane progenitrici dei neuroni corticali e di possedere autoanticorpi contro queste cellule. In questo studio sono stati impiegati 22 paia di sieri (autistici e controlli) in tre diversi gruppi di colture cellulari e si è visto che il siero di bambini autistici incubato per 72 ore provoca alterazioni morfologiche nei neuroni corticali di topo in coltura, in particolare diminuzione della densità cellulare e della lunghezza dei neuriti, mentre non si osservano alterazioni incubando le cellule con sieri di soggetti normali. Pretrattando le colture per tre ore col peptide P6 le alterazioni indotte dai sieri autistici non si verificavano. Tutti i dati erano statisticamente significativi. I sieri autistici, ma non quelli normali, inoltre inducevano un grado significativo di morte cellulare, prevenuta dal peptide P6. Infine i sieri autistici inducevano un aumento di produzione di specie reattive dell’ossigeno e di danni cellulari ossidativi come la perossidazione lipidica, sempre contrastati dal peptide P6.
I livelli di fattori neurotrofici sono alterati nei sieri di bambini autistici.
I livelli di alcuni fattori neurotrofici sono stati misurati con un metodo immuno-elettroforetico (Western blotting) in tre sieri autistici che avevano provocato le alterazioni sopraddette e tre controlli; i livelli di CNTF e BDNF erano fortemente diminuiti, mentre i livelli di pro-BDNF, FGF-2 e LIF erano aumentati e quelli di NGF non subivano alterazioni.
I sieri di bambini autistici inducono in ratti neonati un ritardo dello sviluppo impedito dal co-trattamento col peptide P6.
Gli stessi gruppi di 3 sieri autistici e 3 sieri controllo usati per l’esperimento precedente sono stati utilizzati in assenza o in presenza del peptide P6 mediante iniezione intra-cerebro-ventricolare in ratti entro 12 ore dalla nascita. Sono stati impiegati 5 gruppi di animali comprendenti ognuno 5-6 individui: (1) ratti controllo iniettati soluzione fisiologica; (2) ratti iniettati con sieri autistici (5-6 per ogni siero); (3) ratti iniettati con sieri controllo (5-6 per ogni siero); (4) ratti iniettati con sieri autistici più P6; (5) ratti iniettati con sieri controllo più P6.
E’ stata innanzi tutto presa in esame la comparsa del riflesso di raddrizzamento passando da una posizione supina fino ad appoggiare le zampe sulla superficie: questo riflesso esprime il grado di sviluppo dei processi di equilibrio e coordinazione motoria. Nei controlli iniettati con soluzione fisiologica e nei ratti trattati con sieri normali il riflesso compare dopo circa 4 giorni di vita, mentre nei ratti trattati con sieri autistici la comparsa è significativamente più tardiva. Il peptide P6 tende a migliorare la comparsa del riflesso in questi ultimi animali. Simili risultati erano ottenuti valutando la capacità dell’animale di raddrizzarsi durante una caduta da 12 cm. Un riflesso avente simile scopo è quello della geotassi negativa, in cui il ratto è messo a testa in giù su un piano inclinato e si misura la capacità di ruotare di 180° per mettersi a testa in su. Anche in questo caso nei ratti iniettati con sieri autistici il riflesso compariva in modo significativamente più tardivo; l’effetto positivo del P6 era visibile ma non in modo statisticamente significativo. Dei numerosi test applicati alcuni però non hanno dato variazioni significative fra i vari gruppi. Gli autori osservano tuttavia che i test più idonei a misurare coordinazione e apprendimento di particolari abilità erano positivi, mentre quelli atti a valutare più che altro riflessi inconsci erano negativi.
Per valutare la capacità di comunicazione sociale nei ratti neonati è stato usato un test che misura come forma di linguaggio gli ultrasuoni emessi come richiamo quando i neonati vengono allontanati dalla madre e dagli altri piccoli. Usando questo test è stato visto che il numero di richiami dei ratti posti in isolamento nei giorni 5, 7, e 9 dalla nascita era molto minore nel gruppo iniettato con sieri di bambini autistici che nei controlli non iniettati o iniettati con sieri normali. Il trattamento con P6 non produceva tuttavia alcun effetto significativo.
Il trattamento col peptide P6 migliora il comportamento sociale di ratti giovani trattati con sieri di soggetti autistici.
Il test consiste nel porre giovani ratti (21-23 giorni di vita) in una scatola divisa in 3 camere comunicanti in cui l’animale viene messo in contatto con un suo simile in confronto ad un oggetto inanimato, e in un altro tipo di prova con un altro ratto già noto rispetto ad uno completamente sconosciuto In entrambi i tipi di prova i ratti iniettati con sieri autistici manifestavano un comportamento anormale con interazione sociale diminuita e scarsa propensione per le novità di interazione in confronto con i controlli. Questi comportamenti nel ratto sono considerati corrispondenti al comportamento sociale autistico nell’uomo. Il trattamento col peptide P6 ristabiliva in gran parte il comportamento normale.
I sieri di bambini autistici inducono in cervelli di ratti giovani neurodegenerazione e aumentano lo stress ossidativo e lo stato infiammatorio, contrastati dal peptide P6 tramite aumentata espressione di BDNF.
Parallelamente agli studi dell’effetto dei sieri di bambini autistici su cellule nervose coltivate in vitro è stato condotto uno studio in vivo per valutare l’effetto di tali sieri sul cervello di giovani ratti, valutando la neuro-degenerazione e lo stress ossidativo. Con una metodica istochimica si è dimostrato che i sieri autistici inducevano un marcato grado di neuro-degenerazione in confronto coi controlli non iniettati o iniettati con sieri normali. L’effetto degenerativo veniva impedito dalla somministrazione del peptide P6. Similmente i sieri autistici inducevano un danno ossidativo al DNA, evidenziato dall’aumentata presenza di neuroni positivi alla marcatura di 8-idrossi-deossiguanosina, un prodotto della ossidazione del DNA; anche in questo caso P6 impediva l’insorgere del danno.
Un bio-marcatore di neuro-infiammazione era pure sensibilmente aumentato nei cervelli dei ratti in seguito alla iniezione di sieri autistici ma non di sieri controllo. Anche in questo caso la neuro-infiammazione era inibita dal peptide P6.
Gli autori hanno poi esaminato l’effetto dei sieri autistici sull’espressione dei fattori di crescita BDNF e CNTF nella corteccia cerebrale di ratti giovani, valutando sia i livelli delle rispettive proteine che quelli dei corrispondenti RNA messaggeri (mRNA). Per quanto riguarda BDNF i sieri autistici determinavano una marcata diminuzione dei livelli proteici e di mRNA, indicando una diminuita trascrizione del gene come causa dei diminuiti livelli proteici. Ancora una volta il peptide P6 ristabiliva i livelli normali. Per quanto riguarda invece CNTF non si sono osservate variazioni importanti. Presumibilmente il peptide P6 agisce tramite stimolazione dell’espressione genica di BDNF.
DISCUSSIONE
Tra le varie ipotesi formulate per l’eziologia dei disordini dello spettro autistico, una delle più importanti suggerisce uno sbilancio precoce dei fattori neurotrofici tale da fornire un inappropriato milieu per lo sviluppo del sistema nervoso. Questo studio dimostra che alterazioni nei livelli di alcuni fattori neurotrofici nel siero di individui autistici possono indurre caratteristiche neuro-comportamentali di tipo autistico nei ratti. La somministrazione del peptide P6 che mima la parte attiva di un fattore proteico neurotrofico, il CNTF, è in grado di impedire i deficit di tipo autistico probabilmente tramite elevazione dei livelli di un altro fattore neurotrofico, il BDNF.Questi risultati provvedono un razionale per uno screening diagnostico sui sieri autistici nonché di una possibile terapia basata su regolazione dello sbilancio neurotrofico. Inoltre questo studio permette di creare un modello animale dell’autismo tramite iniezione di siero di soggetti autistici.
Tra i fattori neurotrofici, il BDNF sembra avere un ruolo essenziale nello sviluppo del sistema nervoso centrale, in particolare la formazione di nuovi neuroni, di sinapsi, e nella plasticità sinaptica, cioè la capacità delle sinapsi di svilupparsi sulla base degli stimoli ricevuti, tutte capacità che sono diminuite in bambini, adolescenti ed adulti con autismo. Lo sbilancio in fattori neurotrofici insieme all’aumentato stress ossidativo possono contribuire in modo determinante alla patogenesi dell’autismo. Lo stress ossidativo, portando ad alterazioni strutturali delle proteine, dei lipidi e del DNA dei neuroni, può ben contribuire alle alterazioni funzionali proprie dell’autismo stesso. Non è chiaro come l’aumentata produzione di specie reattive dell’ossigeno sia collegata allo sbilancio neurotrofico, ma è comunque evidente che i sieri di soggetti autistici, che hanno alterati livelli di fattori neurotrofici, inducono stress ossidativo e uno stato neuro-infiammatorio; pertanto il disturbato ambiente neuroumorale può creare a sua volta un ambiente ossidante e pro-infiammatorio, che porta a danni strutturali e funzionali ai neuroni. L’ipotesi è suffragata dal fatto che la sola aggiunta del peptide P6, ristabilendo i livelli di BDNF, risolve tutte le altre anomalie riscontrate.
Giorgio Lenaz, Professore emerito di Chimica Biologica dell’Universitá di Bologna.
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ubblicato con il permesso di Daniela Mariani Cerati neuropsichiatra al Policlinico Sant’Orsola Malpigli di Bologna, da tempo si occupa delle tematiche legate all’autismo anche come moderatrice di una delle liste più autorevoli sull’argomento: autismo33